Хроматин, эпигенетика и репарация генетических повреждений
Естественным носителем генетической информации в эукариотической клетке является хроматин - нуклеопротеиновый комплекс, состоящий из ДНК, гистонов и негистоновых белков [1]. Именно в хроматине происходит реализация генетической информации, а также репликация, репарация и рекомбинация ДНК. Низшим уровнем иерархической организации хроматина является нуклеосомный.
Основной повторяющейся
единицей хроматина является нуклеосома, образованная
147 парами оснований ДНК, закрученными вокруг октамера,
образованного коровыми гистонами H2A, H2B, H3 и H4. Эти так называемые канонические гистоны включаются в
хроматин исключительно в S-фазе, их экспрессия регулируется клеточным циклом и
они транскрибируются с нескольких генов, обычно распределенных в кластеры.
Гистон Н1 взаимодействует с концами линкерной ДНК в районе тетрамера
Н3-Н4.
Для
всех гистонов, кроме H4, показано существование альтернативных вариантных
гистонов, которые, в некоторых случаях, могут заменять канонические гистоны в
составе нуклеосом.
Вариантные формы гистонов – это белки, структура которых в основном
совпадает со структурой гистона, но свойства несколько изменены из-за того, что
по некоторым функциональным доменам происходят аминокислотные замены.
Молекула каждого гистона состоит из центрального структурированного трехспирального домена (одного длинного и двух коротких альфа-спиральных участков, соединенных петельным сегментом) и неструктурированных N- терминальных «хвостов».
Дальнейшая упаковка хроматина достигается за счет
взаимодействия ДНК с негистоновыми белками. Однако, именно нуклеосома играет
центральную роль в упаковке ДНК на всех уровнях. Межнуклеосомные
взаимодействия определяют степень компактизации ДНК,
что соответственно облегчает или затрудняет доступ к ДНК многочисленным
регуляторным факторам.
Эпигенетическая
регуляция
Хроматин является не просто пассивным «упаковщиком» ДНК,
но и носителем эпигенетической информации. Эпигенетическое
наследование, т.е. наследуемое изменение функционального состояния генов не
сопровождающееся изменением их нуклеотидных последовательностей, является фундаментальным для регуляции
развития многоклеточных организмов [2]. В
эукариотическом геноме эпигенетические изменения
переключают функциональное состояние генов из
активного в молчащее и наоборот. В свою очередь, нарушения эпигенетических регуляций
приводят к развитию многочисленных заболеваний, в том числе раковых [3,
4].
Основными (но далеко не единственными) механизмами кодирующими эпигенетическую информацию являются метилирование ДНК и динамичные преобразования хроматина. Возникновение
эпигенетических регуляций обусловлено появлением в определенных участках генома
эпигенетических изменений-меток, представляющих создаваемые специфическими
энзимами модификации ДНК (метилирование CpG-динуклеотидов) или хроматина (ацетилирование,
метилирование, юбиквитинирование,
фосфорилирование гистонов, а также введение в состав
хроматина специфических, вариантных гистонов), которые изменяют доступность ДНК
для транскрипции. Хроматин является
весьма динамичной структурой, позволяющей как быстро реагировать на внутри-и
внеклеточные сигналы, так и поддерживать
состояние активности или неактивности генов. При этом процессы
модификации ДНК и хроматина не независимы, а отражают разные стороны одного
механизма. В частности, метилирование ДНК может быть
предварительным условием метилирования гистонов.
Эпигенетические регуляции носят обратимый характер и могут вызываться как
мутациями отдельных генов, так и воздействиями окружающей среды. Повышенный интерес к ним связан с тем, что эпигенетические
изменения играют ключевую роль в процессе ракового перерождения клеток,
развитии опохолей и возникновении устойчивости
раковых клеток к лекарственным препаратам [3]. Обратимость
эпигенетических регуляторных механизмов создает возможность для коррекции
аберрантных эпигенетических изменений в опухолевых клетках с помощью
лекарственных препаратов. Таким образом, исследование эпигенетических
механизмов и различных факторов участвующих
в эпигенетической регуляции имеет не только фундаментальный характер, но и создет предпосылки для разработки новых методов антираковой
терапии.
Исследования эпигенетических
регуляций является одним из наиболее значимых и динамично развивающихся
направлений современной биологии. Здесь мы сосредоточимся, прежде всего, на
таких процессах преобразованиях хроматина, существенных для эпигенетической
регуляции, как процессы сборки и ремоделирования
хроматина и на роли преобразований хроматина в репарации повреждений ДНК.
Преобразования хроматина осуществляется с
помощью трех основных взаимосвязанных механизмов:
1.
ковалентной модификации
гистонов,
2.
АТФ-зависимого ремоделирования хроматина
3.
включение вариантных
гистонов в хроматин.
Комбинации таких изменений рассматриваются в качестве фундаментального эпигенетического
дополнения к генетическому коду [5]. Посттрансляционные ковалентные модификации гистонов создают
эпигенетические изменения, которые определяют функциональное состояние
различных участков генома — гистоновый код [6]; [7]; [8]; [9]; [10]. АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие
белки модифицируют структуру хроматина, изменяя ДНК-гистоновые
контакты. Такие изменения приводят к перемещению или удалению
нуклеосом, что и определяет «молчание» или активность
генов [11]; [12]; [13]; [14]; [15]; [16]; [17]. Вариантные гистоны и факторы,
вовлеченные в доставку этих гистонов в хроматин, играют существенную роль в
контроле хромосомной архитектуры, экспрессии генов, репарации и формировании
эпигенетической памяти.
Ковалентная модификация гистонов
Посттрансляционные модификации гистонов могут
определять дальнейшую судьбу клетки [6]. Например, фосфорилирование
остатков серина в положении 10 и 28 гистона НЗ
является маркером низкой транскрипционной активности. Комбинация фосфорилирования серина в
положении 10 и ацетилирования лизина в положении 14
гистона НЗ является признаком активной транскрипции. В целом, предполагается,
что множественные модификации, имеющие место в определенных местах гистонов
представляют собой код, который влияет на то, какие белки способны
взаимодействовать с комплексами гистонов и ДНК и, следовательно, какие гены
регулируются этими белками [18]; [8]; [19].
Кроме того
существует так называемая «эпигенетическая память». Это
означает, что клетка «запоминает» паттерн гистоновых
модификаций и способна сохранять его при делении [20]; [21]. При нарушении передачи информации гистонового кода или при сбое в его реализации могут
возникать тяжёлые нарушения не только на клеточном уровне, но и серьёзные
патологии на организменном уровне [6].
АТФ-зависимое
ремоделирование хроматина
АТФ-зависимые
хроматин-ремоделирующие белки модифицируют
структуру хроматина, изменяя ДНК-гистоновые контакты.
Эти факторы могут модифицировать структуру хроматина с
помощью различных механизмов: нуклеосомы могут быть
собраны в состав хроматина или удалены, коровые
гистоны могут быть заменены на вариантные, может быть изменена позиция нуклеосом по отношению к последовательности ДНК [14, 22]. Хроматин – ремоделирующие факторы представляют
собой структурно и функционально различные белковые комплексы, но все они
содержат белки из SNF2-семейства АТФаз в качестве
каталитической субъединицы. Белки семейства SNF2 разделены на 24 подсемейства на основании сравнения
структуры их геликазного домена. Эти подсемейства
также отличаются друг от друга наличием или отсутствием дополнительных доменов,
таких как бромо- и хромодоменов или PHD- и RING-
пальцевые доменов [23]. Эти подсемейства объединяют в 4 – 7 больших семейств, из которых yаиболее хорошо охарактеризованы 4 - SWI/SNF, ISWI, CHD и INO80 [14]; [24]; [25].
Схема характерных доменов для АТФазной субъединицы
каждого семейства хроматин-ремоделирующих белков.
Каждое семейство содержит АТФазную субъединицу из SWI2/SNF2 суперсемейства. АТФазный домен в этих субъединицах разделён на две части DExx (красная) и HELICc (оранжевая). Комбинация доменов на С- и N-терминальных концах или прилегающие домены к АТФазному в каждом семействе различаются. Белки из SWI/SNF, ISWI и CHD семейства имеют небольшую инсерцию, разделяющую АТФазный домен. Каталитическая субъединица из семейства INO80 содержит длинную разделяющую инсерцию (жёлтая). Бромодомен (светло-зелёный) и HSA (helicase-SANT) домен (тёмно-зелёный) принадлежат к SWI/SNF семейству. SANT-SLIDE домены (светло- и темно-синий) — для семейства ISWI, тандем хромодоменов (розовый) относится к семейству CHD, а HSA домен (тёмно-зелёный) к INO80 семейству [24].
АТФ-зависимые хроматин ремоделирующие факторы и субъединицы их белковых комплексов [24].
Включение вариантных гистонов в хроматин
Вариантные гистоны млекопитающих
Для всех гистонов, кроме Н4,
показано существование альтернативных вариантных (замещающих) гистонов которые
могут заменять канонические гистоны в составе нуклеосом
[26]. Предполагается,
что нарушения регуляции сборки хроматина, содержащего вариантные гистоны, может
вести к возникновению онкологических заболеваний, стерильности, нарушений в
центральной нервной системе и быть связано со старением [27].
Включение вариантов гистонов H3 и H2A, таких как,
например, H3.3, CENP-A или H2A.Z, в состав нуклеосом
коррелирует с функциональной спецификацией различных регионов генома[26, 28]. В активно
транскрибирующихся генах вместо гистона Н3 встраивается его вариант Н3.3. Считается, что замещение гистона Н3 вариантным гистон Н3.3
происходит в процессе независимой от репликации сборки хроматина [28]. Показано,
что гистон H3.3 может служить истинной эпигенетической меткой, позволяющей
поддерживать активное состояние экспрессии генов в ряду клеточных поколений [29]. Положение
центромеры в хромосомах высших организмов и
поддержание ее идентичности в ходе клеточных делений определяется эпигенетически с помощью другого, цетромер-специфичного,
варианта гистона H3 – cenH3 (CENP-A, cid). Центромерный хроматин у человека и дрозофилы состоит из
чередующихся блоков, в которых находятся CenH3- или H3-содержащие нуклеосомы, и фланкирован прицентромерным
гетерохроматином [30]; [31]. [32]; [33].
Несколько вариантов
гистона H2A также могут замещать его в процессе нерепликативной
сборки хроматина. Вариантная форма гистона Н2А — H2AZ обнаруживается в нуклеосомах активно транскрибирующихся участков хроматина и
предотвращает образование факультативного гетерохроматина [32]. В центромерных
блоках H3-содержащего хроматина у человека и дрозофилы коровый
гистон H2A заменен на вариантную форму H2A.Z (H2Av у дрозофилы).
На этапе “узнавания” повреждения ДНК ключевым ответным
хроматин-ассоциированным событием на возникновение двунитевого разрыва (ДР) ДНК
является фосфорилирование вариантных гистонов Н2Аv и Н2АХ у дрозофилы и
млекопитающих, соответственно [27].
Сборка хроматина
Сборка
хроматина представляет собой принципиально важный процесс необходимый для
дупликации хроматина после репликации ДНК. Кроме того, удаление и включение гистонов
происходит постоянно в течении клеточного цикла, в ходе таких процессов
метаболизма ДНК как, например, транскрипция, репарация или рекомбинация.
Процессы сборки и разборки хроматина является важнейшими компонентами
регуляторной сети, контролирующей продвижение клеток по клеточному циклу и процессы, происходящие в
ходе развития организма.
В
делящихся клетках эукариот сборка хроматина происходит в ходе репликации ДНК, когда
“родительские” и вновь синтезированные гистоны распределяются между дочерними
нитями ДНК [34]; [35].
Кроме
того, удаление и включение гистонов происходит постоянно в течении клеточного
цикла, в ходе таких процессов метаболизма ДНК как, например, транскрипция,
репарация или рекомбинация. Независимая от репликации сборка
хроматина вовлекает исключительно гистоновые варианты
(например, H3.3, H2A.Z, CenpA), в то время
канонические гистоны (H2A, H2B, H3.1, H3.2, H4) могут быть включены только во
время репликации [34]; [28].
Факторы сборки хроматина
Для эффективной сборки хроматина
необходимо взаимодействие факторов относящихся к двум различным классам: гистоновых шаперонов и
АТФ-зависимых SWI/SNF–подобные хроматин-ремоделирующих
факторов [36]; [37]; [38]; [39]. Гистоновые шапероны играют роль как в доставке вновь синтезированных гистонов в ядро, так и во включении гистонов в хроматин [40]; [41]. Участие специфических шаперонов определяет репликативно
– ассоциированный и независимый от репликации пути сборки хроматина [42].
Гистоновые шапероны
Гистоновые шапероны экранируют заряд
гистонов, обеспечивая правильную сборку нуклеосомы. Без них ДНК образует с молекулами гистонов нерастворимый комплекс
[38].
Шаперон CAF-1 (Chromatin
assembly factor-1) является гетеротримерным
белковым комплексом, состоящим из субъединиц p150, p60 и p48 [43]. При иммунопреципитации шаперон выделяется в комплексе с гистонами H3 и H4, где H4 ацетилирован аналогично только что синтезированному H4.
CAF-1 находится в репликативной вилке, где
взаимодействует с PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)
и способствует доставке гетеродимеров H3-H4 на сайты
синтеза ДНК, обеспечивая сборку новой нуклеосомы в
вилке репликации [44]. Было показано, что CAF-1 также играет существенную роль в процессах
репарации [45].
Шаперон NAP1 (Nucleosome
Assembly Protein-1) был идентифицирован как
гистон-связывающий белок, облегчающий включение нуклеосом
в хроматин [46]. NAP1 является гомомультимером,
с кислым карбоксильным концом. Шаперон доставляет
гистоны H2A, H2B в хроматин во время S-фазы [47].
Шаперон HIRA (histone regulator A) участвует в
процессах независимой от репликации сборки хроматина. HIRA относится к
семейству HIR белков, в которое входят дрожжевые белки Hir1p и Hir2p [48]. Hir1p и Hir2p являются ортологами N- и
C-концов белка HIRA. Белки HIRA характеризуются наличием семи
WD-повторов, образующих вторичную структуру под названием «бета пропеллер»
[49]. У мышей HIRA является
жизненно важным геном, при выключении которого эмбрионы погибают на ранней
стадии [50]. Способность HIRA к независимой от синтеза ДНК сборке нуклеосом была обнаружена в экстрактах яиц Xenopus [51]. HIRA и две большие субъединицы CAF-1 были найдены в
комплексах с гистонами H3.3 и H3, соответственно. Это подтверждает
существование разных путей сборки хроматина, которые отличаются по их
зависимости от синтеза ДНК, собирающих хроматин факторов и предпочитаемых типов
гистонов H3.
Шаперон Asf1 (Anti-silencing
factor-1) участвует и в зависимой от репликации, и в независимой от репликации
сборке хроматина, связывается со вновь синтезированными димерами
H3-H4 [52]; [53]. Asf1 изначально был определен в
дрожжах как ген, при гиперэкспрессии которого
активируется транскрипция молчащих генов [54]. Делеция
гена asf1 в дрожжах приводит к
нарушениям функции подавления транскрипции, замедлению роста и к
чувствительности к ДНК-повреждающим агентам. Так же как и CAF-1, Asf1 важен в
процессе репарации ДНК [55].
Комплекс RCAF (Replication Coupling Assembly Factor) состоит из белка
Asf1 и специфически ацетилированных гистонов H3 и H4 [55]. Так же как и CAF-1, RCAF ответственен за репликативную сборку хроматина, а гистоны H3 и H4 в
комплексе RCAF ацетилированы аналогично вновь
синтезированным гистонам.
Были идентифицированы шапероны,
которые специфически взаимодействуют с определенными вариантами гистонов. Например, гистон H3.1 был найден в комплексе, содержащем гистоновые шапероны Asf1 и CAF-1,
тогда как H3.3 соочищался в комплексе с шаперонами HIRA и
Asf1 [42]. Содержащий WD повтор белок RbAp48, который является
частью различных модифицирующих хроматин комплексов (например, CAF-1,
Sin3/HDAC, HAT1, NuRD) взаимодействует с центромер- специфичным вариантом гистона H3 - CID у
дрозофилы [56]. Недавно, другой содержащий WD- повтор белок - HJURP был
идентифицирован в качестве одного из CenpA - шаперонов у млекопитающих
[57, 58]. Гистоновый шаперон
NAP1 взаимодействует с H2A-H2B и H2A.Z-H2B димерами in vivo [40, 59], тогда как Chz1 специфичен для H2A.Z-H2B димеров
[60].
Несмотря на существенную роль гистоновых шаперонов,
биохимические исследования процесса сборки хроматина in vitro показали, что это АТФ-зависимый
процесс, и он требует участия гидролизующих АТФ
хроматин-ремоделирующих моторных белков [61]. Эти факторы увеличивают эффективность включения
гистонов в хроматин, а также регулируют расстояние между нуклеосомами
в хроматине[61-65]. Недавно было показано, что в то время как гистоновые
шапероны опосредуют формирование пре-нуклеосомных структур, АТФ-зависимые факторы необходимы для
их преобразования в периодические повторы зрелых нуклеосом
[66]. Более того, участие АТФ-зависимых факторов в сборке
зрелых нуклеосом (хроматин-ассемблирующая активность)
и в ремоделировании хроматина (определении расстояний
между нуклеосомами) обусловлены функционально
различными активностями этих белков [67]. Все известные факторы, способные к
АТФ-зависимому ассемблированию хроматина in vitro, содержат хроматин-ремоделирующие белки ISWI или CHD1 в качестве
каталитических субъединиц.
АТФ-зависимая сборка протяженных периодических
повторов нуклеосом была показана in
vitro также для факторов ACF (ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling
factor [61, 68] и CHRAC (chromatin-accessibility-complex[69] дрозофилы, а также комплекса RSF (remodeling and spacing factor [70]
из клеток человека. Каталитическая субъединица каждого из этих
комплексов относится к ISWI подсемейству SNF2-подобных белков. Недавно выявлен новый АТФ-зависимый фактор сборки
хроматина - комплекс ToRC, образованный белками Toutatis, CtBP и ISWI [71]. Хромодомен-содержащий
белок CHD1 дрозофилы катализирует сборку периодических повторов нуклеосом in vitro [65]. CHD1 относится к CHD подсемейству
SNF2-подобных АТФаз, родственному
ISWI подсемейству.
Фактор
сборки и ремоделирования хроматина ACF/CHRAC
Фактор ACF (ATP-utilizing Chromatin assembly and remodeling Factor) дрозофилы является первым идентифицированным и
наиболее хорошо охарактеризованным АТФ-зависимым фактором сборки хроматина [61, 68]. Этот фактор состоит из двух субъединиц – ACF1 и ISWI. В присутствии гистонового шаперона NAP1 и АТФ реконструированный
из рекомбинантных белков фактор ACF
способен собирать протяженные регулярные повторы нуклеосом
из ДНК и гистонов [62]. Очень сходными биохимическими активностями обладает фактор CHRAC
(CHRomatin Accessibility
Complex), который помимо ACF1 и ISWI содержит две дополнительные малые
субъединицы - CHRAC14 и CHRAC16 [63, 69, 72]. Оба фактора присутствуют и у человека [73, 74]. Нуль-мутанты
у дрозофилы по гену Аcf1 проявляют дефекты в образовании гетерохроматина и подавлении транскрипции генов. В клеточных экстрактах, полученных из мутантных эмбрионов,
обнаруживается редуцированная АТФ-зависимая активность сборки хроматина [75]. ACF
является хроматин-собирающим фактором, участвующим в формировании и поддержании
«молчащей» структуры хроматина [38].
Изначально АТФ-зависимый фактор сборки и ремоделирования хроматина RSF (remodeling and spacing factor) был выделен из культуры
клеток человека как вспомогательный фактор транскрипции [73]. Комплекс
является гетеродимером, в состав которого входят две
субъединицы: Rsf-1 и hSNF2H, которые гомологичны белкам dRsf-1 и ISWI у дрозофилы [76]. Комплекс RSF может не только ремоделировать
хроматин, но и способен собирать его in vitro [64]. Субъединица Rsf-1 способна самостоятельно собирать нуклеосомы с помошью своей
собственной активности и без участия гистоновых шаперонов, однако, упорядоченная нуклеосомная
структура образуется в результате работы целого АТФ-зависимого фактора hSNF2H-Rsf-1
[64].
Показано, что АТФ-зависимый хроматин-ремоделирующий
фактор RSF вовлечён в
сборку и поддержание центромерного хроматина у
позвоночных [77]; [78]. Амплификация гена Rsf-1 связана с развитием рака
яичников, а образование Rsf-1/Hsnf2H комплекса в опухолевых клетках может
приводить к повышению их выживаемости и росту карциномы яичников [79]; [80]; [81]
Недавно
выявлен новый АТФ-зависимый фактор сборки хроматина - комплекс ToRC, образованный белками Toutatis (Tou),
ISWI и белком ко-репрессором транскрипции CtBP [71]. Сходство доменной структуры белков Tou и Acf1 позволяли предположить, что Tou также может быть компонентом хроматин-собирающего
комплекса. Действительно, было установлено, что комплекс ToRC,
в сочетании с гистоновым шапероном
NAP-1, способствуют осуществлению АТФ-зависимой сборки протяженных
периодических нуклеосомных повторов in vitro.
Наличие всех трех компонентов комплекса ToRC
необходимо для его оптимальной ферментативной активности. Комплекс ToRC является консервативным в эволюции: аналогичный
комплекс hToRC, состоящий из белков hCtBP, TIP5 и SNF2h был выделен и из клеток человека. Белок
дрозофилы Toutatis, является гомологом TIP5 субъединицы комплекса NoRC млекопитающих. Комплекс NoRC,
образованный белками TIP5 и SNF2h существляет
подавление транскрипции генов рРНК (mammalian Nucleolar Remodeling Complex), [82] [83]. Комплекс NoRC привлекает ДНК метилтрансферазу
(Dnmt), и гистон-деацетилазы
(HDAC1) к промоторным областям генов рДНК и вызывает метилирование
лизина 9 и деметилирование лизина 4 в гистоне Н3,
приводя к формированию факультативного гетерохроматина.
CHD1 (Chromo-ATPase/Helicase-DNA-binding protein 1)
относится к CHD подсемейству SNF2-подобных АТФаз, родственному
ISWI подсемейству, и характеризуется наличием трех мотивов. На N-конце
находятся тандемные хромодомены, распознающие ди- или триметилированный в позиции Lys4 гистон H3 (или H3.3),
являющийся меткой активного хроматина. В центре белковой структуры расположен
SNF2-подобный АТФ-азный домен, а далее –
ДНК-связывающий домен.
Фактор Сhd1 является особенно интересным, потому что он является
одним из компонентов системы контроля транскрипции различных генов, и нарушения
в его работе связывают с развитием ряда тяжелых заболеваний человека. Известно,
что гены Chd1 и Chd2 млекопитающих, гомологичные Chd1 дрозофилы, являются онкогенами. Мутации
в гене Chd1 связаны с раком простаты [84]; [85]; [86]. Сhd1 рассматривают и как ген, мутации которого могут
способствовать развитию рака груди [87]. Делеция Chd2 у мышей вызывает предрасположенность к лимфомам
[88]. Наконец, фактор Chd1
и взаимодействующие с ним гистоновые шапероны HIRA,
Asf1
и Spt6
контролируют «молчание» копий вирусов, интегрированных в
активно-транскрибирующиеся участки генома [89]; [90]. Кроме того, было показано, что белок Chd1 регулирует различия между плюрипотентным и мультипотентным состоянием эмбриональных стволовых клеток [91].
CHD1 изначально был охарактеризован как хроматин-ремоделирующий белок, связывающийся с регионами активной
транскрипции – пуфами и междисками в политенных
хромосомах личинок третьего возраста Drosophila [92]. Исследования на дрожжах и на
культуре клеток человека показали, что при коиммуопреципитации
Chd1 выделяется в комплексе с
различными факторами элонгации транскрипции и с компонентами системы сплайсинга. Chd1 участвует в регуляции
элонгации и терминации транскрипции [93]; [94]; [95]; [96]; [97].
Исследование функций Chd1 in vivo
у Drosophila melanogaster показало,
что белок играет существенную роль в раннем развитии дрозофилы. Chd1 необходим для
независимого от транскрипции и репликации включения вариантного гистона H3.3 в
отцовский пронуклеус в процессе реорганизации
хроматина спермия, а также для сборки H3.3-содержащего хроматина на более
поздних этапах эмбриогенеза [98].
Взрослые особи Drosophila с нефункционирующим CHD1
выживают, но стерильны. Стерильность у самок приводит к 100%
материнскому эффекту смертности эмбрионов и неспособности отцовского генома
преодолеть первый зиготический митоз, в результате чего
образуются нежизнеспособные гаплоидные эмбрионы [98]. В процессе образования мужского пронуклеуса происходит удаление протаминов, после чего
следует независимая от репликации сборка хроматина отцовского генома - в деконденсирующийся спермий включается не канонический, а
вариантный гистон H3.3 - и именно этот процесс нарушен у нуль – мутантных по гену Chd1особей. Аналогичный фенотип был
обнаружен у мутантов по Н3.3- специфичному шаперону HIRA, который также необходим для репликативно- независимой сборки хроматина в мужском пронуклеусе [99]. В отличии от Hira - мутантных яиц, у которых мужской нуклеус лишен
гистонов, в мужском пронуклеусе chd1 мутантных эмбрионов на периферии ядра детектируются гистоны,
однако они не встраиваются в хроматин.
Методами коиммунопреципитации
было показано, что CHD1 и HIRA физически взаимодействуют друг с другом.
Таким образом, CHD1 кооперирует с HIRA для осуществления быстрой и эффективной
RI сборки нуклеосом, как показано на рисунке.
Модель АТФ-зависимой сборки нуклеосом в мужском пронуклеусе дрозофилы с помощью CHD1 и HIRA.
Данное
исследование выявило, что CHD1 является ключевым фактором в независимой от
репликации сборке хроматина и впервые продемонстрировало необходимость АТФ-зависимых факторов для сборки хроматина in vivo.
Таким образом, исследования функций факторов сборки
хроматина in vivo показывают,
что АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие факторы,
такие как CHD1, участвуют не только в ремоделировании существующего хроматина, но и в сборке
хроматина из ДНК и гистонов de novo.
Роль преобразований хроматина в репарации повреждений
ДНК
В клетке молекула ДНК постоянно испытывает
повреждающее воздействие внутренних и внешних факторов. Система репарации ДНК осуществляет
исправление повреждений молекулы ДНК и тем самым обеспечивает поддержание
стабильности генома.
В настоящее время картина функционирования
репарационных механизмов постоянно расширяется за счет информации о процессах,
связанных с изменением структуры хроматина во время исправления повреждений
ДНК. Преобразования хроматина необходимы для обеспечения доступности
поврежденной ДНК для репаративных ферментов. Однако исследования последних лет показали, что различные
преобразования структуры хроматина являются также важнейшим механизмом
регуляции процессов репарации на всех ее этапах и сигнализации о ее завершении [100, 101]. Преобразования хроматина в
процессе репарации повреждений ДНК происходят в ходе таких процессов, как 1)
распознавание повреждения ДНК и сигнализация о повреждении; 2) раскрытие
хроматина для репарации повреждения; 3) восстановление хроматина после
завершения репарации ДНК и сигнализация о завершении репарации.
На этапе “узнавания повреждения” происходит ослабление
связи “ДНК-гистон”, что приводит к снижению компактизации
хроматина и возможности последующего удаления нуклеосом
из района повреждения. Снижение компактизации
хроматина обеспечивается при помощи таких модификаций гистонов как: моно- и дифосфорилирование, метилирование и убиквитинилирование
[102, 103].
На этапе “узнавания” о повреждении ключевым ответным хроматин-ассоциированным событием на возникновение двунитевого разрыва (ДР) ДНК является фосфорилирование вариантных гистонов Н2Аv и Н2АХ у дрозофилы и млекопитающих, соответственно, и гистона Н2А дрожжей, которое происходит в течении нескольких минут после повреждения ДНК . Фосфорилированный гистон Н2АХ (γ-H2AX ) является ключевым фактором амплификации сигнала о повреждении и образует платформу для привлечения репаративных и чекпойнтных белков, а также когезинов [104-106]. Хотя фосфорилирование гистона Н2АХ не является необходимым для изначального рекрутирования репапативных, хроматин-ремоделирующих и чекпойнтных белков к сайтам ДР, оно требуется для их аккумуляции и сохранения в районе ДР и для амплификации сигнала [107, 108]. Мыши, у которых отсутствует гистон Н2АХ, являются радиочувствительными и характеризуются повышенной частотой хромосомных аберраций [109]. Фосфорилирование Н2АХ осуществляется ATM, ATR-киназами и ДНК-зависимой протеинкиназой (DNA-PK) [110-112]. Для осуществления фосфорилирования гистона Н2АХ на ранних этапах репарации необходимо привлечение хроматин-ремоделирующих факторов SWI/SNF семейства: комплексов INO80 и SWR1 [113, 114]. Белок – медиатор MDC1 взаимодействует с γ-H2AX и привлекает АТМ-киназу для его дальнейшего локального фосфорилирования [115]. В результате происходит распространение γ-H2AX доменов на значительные расстояния (до 2 Мпн) и поддержание сигнала до завершения репарации. Независимо от фосфорилирования гистона Н2А происходит привлечение к точке разрыва еще однго ХРФ семейства SW/SNF – RSC, являющегося одним из наиболее ранних сенсоров повреждения ДНК [116-118]. Помимо фосфорилирования гистона H2AX на этапе распознавания повреждения и амплификации сигнала происходит целый каскад различных модификаций гистонов: метилирование Н4 [119], убиквитинилирование лизина 123 гистона Н2В у дрожжей [120, 121], метилирование лизина 79 гистона Н3 Dot1-метилтрансферазой [122].
На этапе “распаковки” хроматина гистон ацетилтрансферазные
комплексы dHAT1, hTip60 и yNuA4 ацетилируют лизины в
N-терминальных доменах гистонов Н3 и Н4, дестабилизируя нуклеосомную
структуру и тем самым обеспечивая доступность повреждения для репарационных
комплексов [123-125]. Комплексы RSC и INO80 осуществляют удаление нуклеосом
с концов ДР ДНК [126, 127].
На завершающем этапе репарации происходит удаление
модификаций, связанных с маркированием повреждений ДНК и восстановление
структуры хроматина, характерной для данных районов хроматина до возникновения
повреждения. В удалении фосфорилированных
гистонов Н2А задействован SWR1 комплекс и действует он как антогонист
INO80 [128]. У дрозофилы для удаления фосфорилированного
гистона Н2Аv из хроматина необходим гистонацетилазный
комплекс Tip60, содержащий АТФ-азу Domino (гомолог
SWR1) [124]. Деацетилирование гистонов протекает при
помощи таких гистонацетилазных комплексов как:
Sin3/Rpd3, Sir2, и Hst1 у дрожжей [129, 130] и Hdac3 у млекопитающих [131].
Заключением в репарационном процессе является
восстановлении хроматиновой структуры, т. е. сборка упорядоченной нуклеосомной последовательности. Кроме того, должен быть
восстановлен ландшафт эпигенетических модификаций, характерных для данных
районов хроматина до возникновения повреждения. Восстановление структуры хроматина
по завершению репарации является крайне важным, но и наименее изученным этапом
в процессах преобразований хроматина в ходе репарации. В
исследованиях на дрожжах показано, что репарация ДНР ДНК сопровождается
выбросами из хроматина значительного числа нуклеосом
в результате действия INO80 и RSC [132]. Ацетилирование лизина 56 в
гистоне Н3 играет критическую роль в сборке
нуклеосом по завершении репарации ДНР [133]. Гистоновые
шапероны CAF1, Asf1, и FACT рекрутируются к сайтам
повреждения ДНК и необходимы для введения гистонов в состав хроматина после
завершения репарации [134-137].
Предполагается, что именно восстановление структуры
хроматина, а не репарация повреждений сама по себе, является сигналом, указывающим
клетке, что репарация завершена [138].
ЛИТЕРАТУРА
99. Loppin B., Bonnefoy E., Anselme C., Laurencon A., Karr T. L., Couble
P. The histone H3.3 chaperone HIRA is essential for chromatin assembly in the
male pronucleus // Nature. ‒ 2005. ‒ T. 437, № 7063. ‒ C. 1386-90.
100. Королев В. Г. Хроматин
и репарация ДНК // Генетика. ‒ 2011. ‒ T. 47, № 4. ‒ C. 449-59.